- PCR (teste) - o que é a técnica de PCR?
- PCR (teste) - aplicação do método PCR
- PCR (teste) e doença de Lyme
- PCR - resultados. Eles podem ser falsos positivos?
- PCR - resultados. Eles podem ser falso-negativos
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PCR é um teste que vem sendo utilizado no diagnóstico de muitas doenças. O método de PCR permite mostrar a presença direta de bactérias no organismo e, especificamente, seu DNA. A PCR é utilizada, entre outros, em no diagnóstico da doença de Lyme. O que é a técnica de PCR? O que é PCR em tempo real?
Conteúdo:
- PCR (teste) - o que é a técnica de PCR?
- PCR (teste) - aplicação do método PCR
- PCR (teste) - Doença de Lyme
- PCR (teste) - resultados. Eles podem ser falsos positivos?
- PCR (teste) - resultados. Eles podem ser falso-negativos
PCR(reação em cadeia da polimerase) é o principal método usado em laboratórios genéticos e moleculares. Foi desenvolvido em 1983 por Kara Mullis, que recebeu o Prêmio Nobel em 1993.
PCR (teste) - o que é a técnica de PCR?
Teste de PCRconsiste na amplificação múltipla (geralmente em 30-40 ciclos) de um fragmento específico de DNA, por exemplo, genes que codificam proteínas Borrelia, com o uso da enzima polimerase.
Então, para visualizar o fragmento de DNA amplificado, são usados corantes moleculares especiais. A PCR, graças à amplificação de fragmentos de DNA específicos, é um método ultrassensível.
No método de PCR, os fragmentos de DNA são amplificados usando pares de primers específicos para uma determinada região do DNA bacteriano. Por exemplo, as regiões alvo de PCR utilizadas no diagnóstico da doença de Lyme são genes que codificam proteínas, e. 16S rDNA, recA, fla, p66, OspA.
O material biológico a partir do qual o teste pode ser realizado é:
- sangue
- seção de pele do eritema migratório
- líquido cefalorraquidiano
- líquido sinovial ou cartilaginoso
- urina
PCR (teste) - aplicação do método PCR
Além do diagnóstico da borreliose de Lyme, o método PCR pode detectar fragmentos de DNA específicos de outros microrganismos ou humanos. Portanto, o método PCR também é usado em:
- diagnóstico e monitoramento de infecções virais: herpes vírus (herpes vírus, herpes zoster, Epstein-Barr, citomegalovírus), HIV, vírus das hepatites (HBV e HCV)
- diagnóstico e monitoramento de infecções bacterianas, principalmente aquelas bactérias,que não pode ser identificada por meio de culturas, por exemplo, tuberculose
- diagnóstico e acompanhamento de doenças neoplásicas: leucemia, câncer de mama, câncer colorretal, câncer de pulmão
- diagnóstico de predisposição ao câncer: câncer de mama e ovário (genes BRCA1 e BRCA2), câncer colorretal (genes APC e CHEK2)
- diagnóstico de doenças genéticas: hemocromatose (gene HFE), talassemia (genes HBA1 e HBA2), doença celíaca (genes HLA)
- testes de paternidade, que detectam a compatibilidade do DNA da criança e do pai
Atualmente, existem muitas modificações no método PCR. Por exemplo, no diagnóstico da doença de Lyme, os métodos de nested PCR (nested PCR) e PCR em tempo real ( ) são usados principalmente. Este último é um método quantitativo e permite determinar o número exato de cópias de DNA de Borrelia no material biológico testado.
PCR (teste) e doença de Lyme
A base para o diagnóstico da doença de Lyme é o teste sorológico. No entanto, existem situações clínicas que podem fazer com que esses testes sejam falso-negativos:
- janela sorológica, ou seja, o período inicial da infecção em que o organismo ainda não produz anticorpos IgM e IgG específicos contra Borrelia
- em pessoas imunocomprometidas que não produzem anticorpos suficientes
- presença de imunocomplexos que consistem em antígenos de Borrelia e anticorpos específicos para eles e impedem a detecção de anticorpos por métodos sorológicos
Se houver suspeita de sintomas da doença de Lyme e o resultado do teste sorológico for negativo, pode-se realizar um teste molecular baseado no método PCR.
O DNA de espiroquetas de Borrelia pode ser detectado nos estágios iniciais da infecção, pois o número de espiroquetas nos fluidos corporais é então o maior.
No diagnóstico da borreliose de Lyme, métodos sorológicos como ELISA são usados principalmente, mas em algumas situações clínicas o teste genético usando o método PCR é útil.
Quanto maior o tempo de infecção, menor a probabilidade de detecção de DNA bacteriano. Portanto, em alguns casos, antes da realização do teste de PCR, as bactérias são cultivadas em meio especial por 1-2 semanas e, em seguida, o teste é realizado.
Esta abordagem é usada em caso de suspeita de doença de Lyme Lyme e líquido cefalorraquidiano colhido. Na fase tardia da infecção, é mais indicado realizar um teste ELISA.
O método PCR não deve ser utilizado no diagnóstico de rotina da doença de Lyme devido à f alta de padronizaçãosobre a ocorrência de variedades Borrelia burgdorferi na Polônia.
Porém, no caso de dificuldades no diagnóstico (principalmente na fase inicial da doença), o resultado do teste PCR é útil no processo diagnóstico.
Um resultado de teste positivo significa que a presença de DNA de Borrelia burgdorferi e suas variantes foi detectada no material testado, mas não explica se o organismo está ativamente infectado. Por outro lado, um resultado negativo não exclui a presença de bactérias no organismo.
Alguns laboratórios oferecem testes para a presença de DNA de Borrelia no carrapato. No entanto, o resultado de tal teste não é a base para o diagnóstico da doença de Lyme em uma pessoa mordida.
PCR - resultados. Eles podem ser falsos positivos?
A PCR é um método ultrassensível e ao mesmo tempo muito sensível à contaminação. Portanto, é muito importante em testes baseados em PCR selecionar um controle interno apropriado para descartar resultados falso-positivos.
A correta coleta de material para testes, bem como a experiência e confiabilidade do diagnosticador que realiza o teste também são de fundamental importância.
PCR - resultados. Eles podem ser falso-negativos
Como em qualquer teste laboratorial, também no método de PCR podem aparecer resultados falsos negativos. Aqui é crucial coletar sangue para um anticoagulante adequado, pois alguns deles, como a heparina, podem inibir a reação de PCR.
A coleta de material após o início da antibioticoterapia pode diminuir a eficiência da reação de PCR e aumentar a probabilidade de resultados falso-negativos.
Deve-se lembrar também que as bactérias Borrelia vivem por muito pouco tempo no sangue e nos fluidos corporais, porque graças a receptores especiais penetram muito rapidamente em locais "difíceis de alcançar" do corpo.
Portanto, ao contrário do diagnóstico de outros microrganismos, o número de espiroquetas de Borrelia em material biológico é pequeno, às vezes até no limite de detecção do método PCR. Isso também pode causar um falso negativo.
Referências
- Dunaj J. et al.A importância do método PCR no diagnóstico da borreliose de Lyme. Navegar Epidemiol. 2013, 67, 119 - 123.
- Diagnóstico laboratorial de doenças transmitidas por carrapatos Recomendações do Grupo de Trabalho: Câmara Nacional de Diagnosticadores de Laboratório, Instituto Nacional de Saúde Pública-Instituto Nacional de Higiene, Consultor Nacional na área de doenças infecciosas, Departamento de Doenças Infecciosas e Neuroinfecções , Universidade Médica de Białystok, Sociedade Polonesa de Virologia, Varsóvia 2014.
- Ružić-Sabljić E. e Cerar T. Progresso no diagnóstico molecular da doença de Lyme. Especialista Rev Mol Diag. 202217 de janeiro (1): 19-30.
- Valones M.A.A. et al.Princípios e aplicações da reação em cadeia da polimerase em campos de diagnóstico médico: uma revisão. Braz J Microbiol. 2009 janeiro-mar; 40 (1): 1-11.
Karolina Karabin, MD, PhD, bióloga molecular, diagnostica laboratorial, Cambridge Diagnostics PolskaBiólogo de profissão, especializado em microbiologia, e diagnosticador laboratorial com mais de 10 anos de experiência em trabalho laboratorial. Graduado pela Faculdade de Medicina Molecular e membro da Sociedade Polonesa de Genética Humana, chefe de bolsas de pesquisa do Laboratório de Diagnóstico Molecular do Departamento de Hematologia, Oncologia e Doenças Internas da Universidade Médica de Varsóvia. Defendeu o título de doutora em ciências médicas na área de biologia médica na 1ª Faculdade de Medicina da Universidade Médica de Varsóvia. Autor de diversos trabalhos científicos e de divulgação científica na área de diagnóstico laboratorial, biologia molecular e nutrição. Diariamente, como especialista na área de diagnóstico laboratorial, ele dirige o departamento de conteúdo da Cambridge Diagnostics Polska e colabora com uma equipe de nutricionistas da CD Dietary Clinic. Ele compartilha seu conhecimento prático em diagnóstico e dietoterapia de doenças com especialistas em conferências, sessões de treinamento e em revistas e sites. Ela está particularmente interessada na influência do estilo de vida moderno nos processos moleculares do corpo.